Metabolische, physiologische und pathophysiologische Prozesse und deren Mechanismen werden in der Medizin seit Jahren intensiv erforscht. An die „Metabolomics“ wird die Hoffnung geknüpft, neue Erkenntnisse zur Krankheitsentstehung und -verläufen, aber auch grundlegenden physiologischen Prozessen zu gewinnen. Zahlreiche Studien haben Hinweise dafür erbracht, dass aus dem Metabolismus stammende, in der Atemluft nachweisbare flüchtige Substanzen geeignet sind, physiologische und pathophysiologische Prozesse im gesamten Körper abzubilden. Für die klinische Anwendung bietet sich hier die Möglichkeit einer nicht invasiven und ggf. kontinuierlichen Diagnostik bei der pathophysiologische Zustände erkannt und im Verlauf bzw. zur Therapiekontrolle beobachtet werden könnten, ohne den Patienten zu belasten.

Voraussetzung für die vollständige Erfassung der flüchtigen Substanzen ist eine extrem effiziente Trennung der Verbindungen in Kombination mit einer spezifischen Detektion. Dafür müssen mehrdimensionale Trennsysteme eingesetzt werden. Die „comprehensive“ Gaschromatographie (GCxGC) ist aufgrund entsprechend hoher theoretischer Bodenzahl und daraus resultierender Peakkapazität gegenwärtig das einzige System, mit der solch komplexe Trennungen erreicht werden können. In Verbindung mit einem schnellen Massenspektrometer ist eine eindeutige, umfangreiche Identifizierung einzelner Verbindungen möglich (metabolic VOC profiling).

Als Detektoren für die GCxGC kommen Time-of-Flight Massenspektrometer (ToF-MS) oder neuerdings schnellscannende Quadrupol Detektoren in Frage. Auf Grund der hohen Zeit- und Massenauflösungen stellt die ToF-MS die optimale Detektor-Lösung für die GCxGC dar.

 In Kombination mit den von uns speziell für solche Applikationen entwickelten, Point-of-Care einsetzbaren Probennahme- und Präkonzentrations Techniken  ist ein GCxGC-MS System optimal geeignet, umfassendes VOC Profiling durchzuführen und unbekannte Verbindungen aus der Atemluft zu identifizieren. 

Volatile Verbindungen in der Atemluft der Patienten können physiologische und pathophysiologische Prozesse im gesamten Körper abbilden. Die Atemgasanalyse bietet daher optimale Voraussetzungen zur Einführung patientenorientierter nicht invasiver diagnostischer Methoden für die Früherkennung und Diagnose von Erkrankungen, für die Therapiekontrolle und die Beobachtung physiologischer Effekte.  Wegen der geringen Konzentration der relevanten Verbindungen in der Atemluft kommt dem Brückenschlag zwischen Hochleistungsanalytik, klinischer Praxis und praktischer Umsetzung entscheidende Bedeutung zu. Als hochauflösendes Echtzeitmessverfahren ist die PTR-TOF anderen spektrometrischen Verfahren überlegen und bietet damit optimale Voraussetzungen für Identifizierung, Quantifizierung klinisch relevanter (Bio)marker im Ultraspurenbereich in Echtzeit.

Die Protonen-Transfer-Massenspektroskopie (PTR-MS) ist eine inzwischen für den Nachweis gasförmiger Substanzen etablierte Technologie. Die Technik verwendet eine chemische Ionisierung, um volatile organische Verbindungen in Echtzeit nachzuweisen. Der eigentliche Ionisierungsprozess in der „drift tube“ findet im Bereich von ns bis ms statt. Im Gegensatz zu anderen massenspektrometrischen Verfahren ist dieses Verfahren in der Lage, volatile Verbindungen im Spurenbereich ohne relevante zeitliche Verzögerung (atemzugsaufgelöst) zu erfassen. Da die Zielsubstanzen bei der PTR-Ionisierung nicht fragmentiert werden, können diese gut über Ihre molekulare Masse identifiziert werden. Die in bisherigen Gerätegenerationen verwendeten Quadrupol Detektoren limitieren das Potential der Technik, da einerseits nur ein kleine Anzahl verschiedener Molekülmassen (m/z) im Echtzeitmodus erfassbar waren und andererseits isobare Verbindungen mit identischer molekularer Masse nicht unterscheidbar waren. Aufgrund der hohen Auflösung (m/Dm bis zu 8000) und der höheren Messgeschwindigkeit (ca. 500 Da pro Sekunde)  ermöglichen die in den Geräten der neuesten Generation verwendete Time-of-flight (TOF)-Detektoren sowohl die parallele Detektion isobarer Substanzen als auch einen sekundenschnellen Scan des gesamten Messbereiches für volatile Verbindungen. Damit ist die PTR-TOF anderen massenspektrometrischen Verfahren überlegen und bietet daher optimale Voraussetzungen für die schnelle Identifizierung und kontinuierliche Quantifizierung klinisch relevanter Biomarker im Ultraspurenbereich.

Das Gerät ergänzt und erweitert das bereits in der Arbeitsgruppe RoMBAT vorhandene Equipment zum nicht-invasiven Nachweis von Biomarkern optimal ergänzen Durch Einsatz dieses Gerätes in einem Netzwerk aus experimenteller Anästhesie und Intensivtherapie (Prof. Dr. D.A. Reuter), Pharmakologie (Institut für klinische Pharmakologie, Prof. Dr. B. Drewelow), experimenteller Chirurgie (Prof. Dr. B. Vollmar),  analytischer Chemie (Lehrstuhl für analytische Chemie Prof. Dr. R. Zimmermann) und dem interfakultären Massenspektrometrischen Zentrum konnten insbesondere in Kombination mit den bereits an der KAI etablierten Probenvorbereitungs- und Analysetechniken weitere bisher unbekannte und nur im Spurenbereich vorhandene endogene und exogene Markersubstanzen identifiziert werden. Auf diese Weise kann der an der Fakultät vorhandene Wissensvorsprung im Bereich der Spurenanalytik und der nicht-invasiven medizinischen Diagnostik gefestigt und ausgebaut werden.

Das PTR-TOF-MS 8000 entspricht dem neuesten Stand der massenspektrometrischen Technik. Im Rahmen der Doktorandenausbildung und der bereits etablierten Vorlesungen und Praktika konnte diese hochaktuelle Technologie anschaulich in den Bereich der Lehre eingebunden werden. Auch Doktoranden haben die Gelegenheit sich mit aktueller Hard und Software auf dem Gebiet der Massenspektrometrie auseinander zusetzen. Der prinzipielle Umgang mit dem Gerät und mit den gewonnenen Messdaten stellt  eine wertvolle Erweiterung für den Studiengang Biomedizinische Technik dar und kann anschaulich im Rahmen der Praktika (z.B. neue Innovative Methoden am Beispiel der Atemgasanalyse) direkt in die Lehre eingebunden werden.

Ergebnisse aus dem Einsatz der PTR-TOF-MS 8000

Trefz P, Schmidt M, Oertel P, Obermeier J, Brock B, Kamysek S, Dunkl J, Zimmermann R, Schubert JK, Miekisch W. Continuous real time breath gas monitoring in the clinical environment by proton-transfer-reaction-time of flight-mass spectrometry. Anal Chem. 2013 Nov 5;85(21):10321-9.

Sukul P, Trefz P, Schubert JK, Miekisch W. Immediate effects of breath holding maneuvers onto composition of exhaled breath. J Breath Res. 2014 Sep;8(3):037102. doi: 10.1088/1752-7155/8/3/037102. Epub 2014 Sep 4

Sukul P, Trefz P, Kamysek S, Schubert JK, Miekisch W. Instant effects of changing body positions on compositions of exhaled breath. J Breath Res. 2015 Nov 19;9(4):047105. doi: 10.1088/1752-7155/9/4/047105

Sukul P, Schubert JK, Oertel P, Kamysek S, Taunk K, Trefz P, Miekisch W. FEV manoeuvre induced changes in breath VOC compositions: an unconventional view on lung function tests. Scientific Reports 6, Article number: 28029 (2016) doi:10.1038/srep28029

Brock B, Kamysek S, Silz J, Trefz P, Schubert JK, Miekisch W. Monitoring of breath VOCs and electrical impedance tomography under pulmonary recruitment in mechanically ventilated patients. J Breath Res 2017;11(1):016005. DOI: 10.1088/1752-7163/aa53b2

Sukul P, Oertel P, Kamysek S and Trefz P. Oral or nasal breathing? Real-time effects of switching sampling route onto exhaled VOC concentrations. J Breath Res 2017; 11(2): 027101. DOI: 10.1088/1752-7163/aa6368

Obermeier J, Trefz P, Happ J, Staude H, Schubert J K, Fischer D-C, Miekisch W. Exhaled volatile substances mirror clinical conditions in pediatric chronic kidney disease. PLoS One. 2017;12(6): e0178745. DOI: 10.1371/journal.pone.0178745

Sukul, P; Schubert, JK; Kamysek, S; Trefz, P; Miekisch, W. Applied upper-airway resistance instantly affects breath components: a unique insight into pulmonary medicine. 2017; 11(4):047108. DOI: 10.1088/1752-7163/aa8d86

Trefz P, Schubert JK, Miekisch W. Effects of humidity, CO2 and O2 on real time quantitation of breath biomarkers by means of PTR-ToF-MS. J Breath Res 2017;Dec 4. DOI: 10.1088/1752-7163/aa9eea

Wichtige Schwerpunkte unserer Projekte ist die Identifizierung und Quantifizierung neuer Markerverbindungen („Biomarker“) im Ultraspurenbereich (ppbV-pptV). Da viele diese gasförmigen Verbindungen kommerziell nicht verfügbar sind, mussten bisher aufwändige und fehlerbehaftete Verfahren (z.B. Verwendung von flüssigen Standards in „Gasmäusen“) eingesetzt werden, um quantitative Messungen durchführen zu können. Weitere Einflüsse, wie z.B. der Wasser bzw. CO₂ Gehalt der Atemgasprobe liessen sich im Rahmen der Kalibrierung kaum berücksichtigen, stellen aber für viele analytische Verfahren wichtige Einflussgrößen dar. 
Die Liquid Calibration Unit (LCU)  dient zur präzisen Herstellung von Gasstandards. Flüssige Standards können direkt in einen Gasstrom verdampft werden und zusätzlich können Wasser- und CO₂ Gehalt an die Atemgasmatrix angepasst werden.Das Gerät liefert wichtige Impulse für laufende (DFG, EU) Drittmittelprojekte, da damit die Suche und Quantifizierung neuer volatiler Biomarker (z.B. für die Erkennung von Paratuberkulose bei Tieren (DFG „MAP“), die Identifizierung potentieller Krebsmarker bei Patienten (EU-FP7-HCV) oder die Herstellung adaptierter Standards für die Echtzeitmessung volatiler Verbindungen (EU-FP7-PIMMS, -IMPACT) erheblich erleichtert und verbessert werden kann. Durch eine Beschleunigung der Identifizierung und eine Verbesserung der Quantifizierung potentieller Markerverbindungen kann das Gerät erheblich dazu beitragen den führenden internationalen Status der Arbeitsgruppe in dem Forschungsfeld zu festigen und auszubauen.
Besonders wertvoll ist das Geräte  für unsere regionalen Industriekooperationen in der Region mit den Firmen IT Gambert, Wismar (Verbundprojekt DM Nr. 897091/92), Airsense, Schwerin und Dräger, Lübeck (DM Nr.895220U), bei denen relevante Forschungsergebnisse in wirtschaftlich verwertbare Produkte umgesetzt werden sollen. Bei diesen Kooperationen geht es vorwiegend um die Etablierung oder Validierung neuer (Point-of-Care einsetzbarer) sensorbasierter Meßsysteme. Dafür ist insbesondere die Erstellung komplexer Standards (Multikomponenten) mit definierten Konzentrationen und adaptierter Probenmatrix von entscheidender Bedeutung.

Ergebnisse aus dem Einsatz der LCU:
Oertel P, Bergmann A, Fischer S, Trefz P, Küntzel A, Reinhold P, Köhler H, Schubert JK, Miekisch W. Evaluation of needle trap micro-extraction and solid-phase micro-extraction: Obtaining comprehensive information on volatile emissions from in vitro cultures. Biomed Chromatogr. 2018 Oct;32(10):e4285. doi: 10.1002/bmc.4285. Epub 2018 Jun 5.

Trefz P, Schubert JK, Miekisch W. Effects of humidity, CO2 and O2 on real time quantitation of breath biomarkers by means of PTR-ToF-MS. J Breath Res 2018; Dec 4. DOI: 10.1088/1752-7163/aa9eea. PMID:29199640

Der Buffered End-Tidal Sampler ermöglicht eine kontrollierte Probenahme der alveolaren Phase des Atemgases und trägt damit dazu bei, die Sensitivität und Reliabilität der Ergebnisse von Atemgasanalysen erheblich zu verbessern. Durch die Pufferung der end-tidalen Phase können für die bereits eingesetzten und neue Messverfahren (PTR-TOF, Sensoren) längere Messzeiten und damit erhebliche Verbesserungen der Empfindlichkeit/ NWG und der Reproduzierbarkeit erreicht werden. In Kombination mit den von uns speziell für die PoC - Probenahme entwickelten Mikroextaktionsverfahren verbessert dieses System die Möglichkeit, unbekannte Verbindungen aus der Atemluft zu identifizieren, erheblich.